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熒光顯微鏡,也就是這么回事
點擊次數(shù):1460 更新時間:2018-01-29
  熒光顯微鏡,也就是這么回事
  在諸多顯微鏡的觀察模式中,明場成像得到的是光強度zui直接的變化,相差成像等技術也大多是將光的相位差等轉變?yōu)閺姸炔睿谷搜勰軌蚋惺艿健晒獬上窦夹g則是特異性地區(qū)分出光的波長,也就是光的顏色,使人眼能夠區(qū)分。
  光被人眼所看到分為兩種形式:發(fā)光和反光。明場成像屬于反光形式,熒光則屬于發(fā)光形式。
  物體獲得能量后可能產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,能量來源可能是熱能(如白熾燈),化學能(如螢光)或者核能(如陽光),而熒光的能量來源則是另一束能量更高的光。
  高能量的光子與電子碰撞,使得電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的電子很不穩(wěn)定,會重新回落到基態(tài),這個過程中會消耗部分熱能,并發(fā)出新的光子。新的光子能量比zui初的光子能量低,因此波長更長。由于新的光子波長區(qū)別于入射光的光子波長,通過一定的光學處理方法將兩束不同波長的光分開,從而使我們只看到發(fā)射出來的新光子(熒光信號),也就是熒光顯微鏡看到的熒光圖像。
  具有熒光特性的物質叫熒光素,不同的熒光素對不同波長的入射光激發(fā)效率不同,這種差異體現(xiàn)在熒光素的激發(fā)光譜上。同樣的,不同熒光素發(fā)射出的新光子波長也不同,這種差異體現(xiàn)在熒光素的發(fā)射光譜上。因此,了解一種熒光素的實驗方法,主要是了解其激發(fā)和發(fā)射光譜,其中發(fā)射光譜是熒光素的特征光譜。
  實現(xiàn)入射光與發(fā)射光分離的部分是熒光顯微鏡的核心,通常采用三片濾光片結構。
  以白光作為激發(fā)光源時,利用*塊激發(fā)光濾光片將白光過濾,使熒光素對應的zui適激發(fā)波長的光透過。二向色鏡是這個結構的核心,它負責將入射光與發(fā)射熒光分開,使入射光反射進入物鏡,照射到樣本上,樣本中的熒光素便被激發(fā)產(chǎn)生熒光,發(fā)射出來的熒光被物鏡收集后,穿過二向色鏡。熒光再通過發(fā)射光濾光片,選擇具有特征性的發(fā)射光范圍,zui終進入目鏡或者成像設備中。
  以上的結構是常見的熒光顯微鏡成像光路,也被稱作反射熒光光路。
  熒光照明的光源有很多種,理論上普通的白光光源也可以,但是實際上因為熒光的激發(fā)效率很低,因此需要亮度足夠的光源。目前常用的熒光光源有4種:
  汞燈:汞蒸氣激發(fā)光源,傳統(tǒng)熒光光源。
  氙燈:氙弧光燈,光譜連續(xù)且強度平均。
  激光:單色性好,強度高。
  LED:壽命長,單色性較好,亮度高,是今后光源的主要發(fā)展方向。
  熒光成像的優(yōu)勢:
  通過二向色鏡將入射光和熒光區(qū)分開,使我們只看到熒光信號,沒有其他光線的干擾,因此可以看到很微弱的信號,比如單分子熒光。
  因為熒光素可以特異性地標記到不同的細胞或分子上,因此可以區(qū)分不同的細胞或分子。
  不同強度的熒光可以進行比較,從而實現(xiàn)細胞或分子的定量分析。
  目前更的顯微鏡系統(tǒng),如共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、超高分辨率顯微鏡、光切片顯微鏡等都是利用熒光成像方法進行觀察和分析的。

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